Tanto la anotación como la identificación de genes en parásitos patógenos siguen siendo un desafío. Aunque, como factor de supervivencia, se ha demostrado que el óxido nítrico (NO) se sintetiza en (TV), la sintasa de óxido nítrico (NOS) aún no ha sido anotada en el genoma de TV. Desarrollamos una estrategia de testigo a sospechoso para identificar genes incorrectamente anotados en TV a través de los algoritmos de Smith-Waterman y Needleman-Wunsch mediante un alineamiento profundo y repetido de las secuencias codificantes completas de TV contra miles de secuencias de proteínas conocidas de otros organismos. Se identificó con éxito una nueva NOS de TV (TV NOS), que fue anotada como hidrogenasa en la base de datos de NCBI; esta TV NOS tenía una alta relación de testigo a sospechoso y contenía todos los motivos de unión de cofactores de NOS (NADPH, tetrahidrobiopterina (BH4), hemo y dinucleótido de flavina y adenina (FAD)). Para confirmar esta identificación, realizamos modelado in silico de la estructura de la proteína y acoplamiento de cofactores, clonamos el gen, expresamos y purificamos la proteína, realizamos análisis de espectrometría de masas y, finalmente, realizamos un ensayo para medir la actividad enzimática. Nuestros datos mostraron que, aunque la estructura predicha de la proteína TV NOS no era similar a la estructura de las NOS de otras especies, todos los motivos de unión de cofactores podían interactuar con sus ligandos con altas afinidades. Mostramos claramente que la proteína purificada tenía una alta actividad enzimática para generar NO in vitro. Este estudio proporciona un enfoque innovador para identificar genes incorrectamente anotados en TV y destaca una nueva NOS que podría servir como un factor de virulencia de TV.