La prolactina (PRL) es esencial para el crecimiento y la ovulación de los folículos animales, pero su impacto en el reclutamiento folicular en ovejas sigue siendo poco comprendido. Este estudio identificó genes y vías clave influenciados por la inhibición de PRL utilizando secuenciación de ARN y enfoques bioinformáticos. Se observó la localización subcelular del gen clave en el tejido ovárico utilizando un ensayo de hibridación in situ por fluorescencia (FISH) e inmunohistoquímica. La función de estos genes clave se validó a través de experimentos de eliminación de genes y sobreexpresión. Los resultados indican que la inhibición de PRL regula principalmente el reclutamiento de folículos a través del gen objetivo. La localización subcelular en el tejido ovárico de las ovejas estaba presente principalmente en las células de la granulosa ovárica (GCs) y las células del cúmulo (CCs). La sobreexpresión de disminuyó la apoptosis celular y aumentó la liberación de hormonas esteroides, mientras que la eliminación de tuvo el efecto contrario. En conclusión, la inhibición de PRL facilita el reclutamiento de folículos en ovejas al aumentar durante la fase de estro. Estos hallazgos ofrecen una nueva perspectiva sobre cómo PRL regula el reclutamiento de folículos durante el ciclo de estro en ovejas.