El ácido succínico es un dicarboxílico de cuatro carbonos crucial con aplicaciones en las industrias de detergentes, alimentos y farmacéutica. Sin embargo, su producción microbiana a gran escala se ve limitada por la necesidad de agentes neutralizantes y los altos costos de enfriamiento. En este estudio se llevó a cabo la ingeniería metabólica de la levadura termotolerante y acidotolerante Kluyveromyces marxianus para facilitar la biosíntesis eficiente de ácido succínico a alta temperatura y bajo pH. Se estableció una plataforma robusta de manipulación genética para K. marxianus mediante el desarrollo de herramientas de edición génica, la caracterización de sitios de integración neutrales y la identificación de promotores endógenos. Aprovechando esta plataforma eficiente, se construyó y optimizó sistemáticamente la vía biosintética de ácido succínico mediante diversas estrategias de ingeniería metabólica, como la eliminación de rutas de subproductos, la redistribución del flujo de carbono y la mejora del sistema de transporte de ácido succínico. Finalmente, la cepa modificada K. marxianus KmSA12 fue capaz de producir 50.6 g/L de ácido succínico con un rendimiento de 0.31 g/g y una productividad de 0.42 g/L/h en un biorreactor de 5 L. Estos resultados demuestran el potencial de K. marxianus como una plataforma prometedora para la producción a gran escala de diversos ácidos orgánicos.