La especie, un grupo de plantas nativas de Australia, ha sido históricamente valorada por sus propiedades farmacológicas y ha desempeñado un papel significativo en la medicina tradicional y la investigación farmacéutica. Se están llevando a cabo esfuerzos persistentes para mejorar la eficacia del ingrediente activo escopolamina, empleando tanto métodos de cría convencionales como herramientas avanzadas de biotecnología. El objetivo principal de esta investigación fue establecer un método altamente eficiente para aislar protoplastos de mesófilo y facilitar su regeneración, sentando así una base sólida para la aplicación de diversas herramientas avanzadas de biotecnología vegetal en la búsqueda de mejoras genéticas. El proceso de aislamiento de protoplastos de mesófilo se desarrolló para híbridos con una cuidadosa optimización de los siguientes parámetros: tamaño de la tira de hoja; condiciones de incubación; tratamiento físico; y concentración de enzima. Los parámetros óptimos se combinaron en cada paso individual; se determinó que la mejor concentración de enzima era del 2% (/) celulasa y del 0.5% (/) macerasa. Se encontró que el rendimiento de protoplastos se veía muy afectado por las concentraciones de enzima. Los protoplastos aislados se cultivaron a una densidad de 0.5 x 10 para sostener mejor la mayor división celular (33.2%) y una frecuencia de inducción de microcallos del 17.9%. Después de 40 días de cultivo en un medio KM8P modificado a 25 grados C en la oscuridad, los microcallos visibles se transfirieron a un medio sólido de Murashige y Skoog (MS) con 1 mg L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) para la inducción de callos bajo un fotoperíodo de 16 h. Después de 30 días de cultivo, los callos organogénicos compactos se transfirieron a un medio MS sólido con 6-benzilaminopurina (BA) solo o thidiazuron (TDZ) solo o en combinación con BA o ácido naftalenoacético (NAA) para la regeneración de brotes. La máxima frecuencia de regeneración de brotes (63.3%) se observó en el medio con 1.5 mg L de TDZ solo. Por primera vez, se estableció un sistema confiable de aislamiento y regeneración de protoplastos de células de mesófilo con alta viabilidad de protoplastos, formación exitosa de microcallos y regeneración de plantas intactas. Esta innovación contribuirá significativamente a la mejora genética de la especie.