La extracción de metabolitos es uno de los pasos críticos en el análisis del metaboloma microbiano. Afecta tanto el contenido de metabolitos observados como la interpretación biológica de los datos. Varios métodos existen para la extracción de metabolitos de microbios, pero la literatura no es consistente en cuanto al modelo de muestra, la adecuación y el rendimiento de cada método. En este estudio, se investigó un protocolo óptimo de extracción para metabolitos intracelulares. El efecto de cinco protocolos de extracción que consisten en diferentes sistemas de disolventes de extracción (60% metanol, 100% metanol, acetonitrilo/metanol/agua (2:2:1), cloroformo/metanol/agua (2:1:1) y 60% etanol) en perfiles metabólicos fue comparado. El número de picos detectados, la variación de muestra a muestra y el rendimiento de metabolitos se utilizaron como criterios. Los metabolitos extraídos fueron analizados por H-NMR y análisis de componentes principales (PCA), así como análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) de estadísticas multivariadas. El protocolo de extracción que utilizaba 100% metanol como disolvente de extracción proporcionó el mayor número de picos detectados para ambas especies analizadas, ofreciendo más información espectral. Junto con la reproducibilidad y la calidad del espectro, la extracción con 100% metanol fue adecuada para la extracción de metabolitos intracelulares de ambas especies. Sin embargo, dependiendo de los metabolitos de interés, otros disolventes podrían ser más adecuados para estudios futuros, ya que se observaron perfiles distintos entre los métodos de extracción.