Una interacción dinámica entre las células de cáncer de próstata (PCa) y el estroma óseo reactivo modula el crecimiento de las metástasis dentro del microambiente óseo. De las células estromales, se sabe que los fibroblastos asociados a metástasis (MAFs) contribuyen, pero son el tipo de célula menos estudiado en la progresión tumoral del PCa. El objetivo del presente estudio es establecer un modelo in vitro 3D biológicamente relevante que imite los perfiles celulares y moleculares de los MAFs encontrados in vivo. Utilizando modelos de cultivo celular in vitro 3D, la línea celular de fibroblastos derivados del hueso, HS-5, fue tratada con medios condicionados de líneas celulares de PCa derivadas de metástasis, PC3 y MDA-PCa 2b, o fibroblastos derivados de ratón 3T3. Se propagaron dos líneas celulares reactivas correspondientes: HS5-PC3 y HS5-MDA, y se evaluaron las alteraciones en la morfología, fenotipo, comportamiento celular, así como los perfiles proteicos y genómicos. HS5-PC3 y HS5-MDA mostraron alteraciones distintas en los niveles de expresión de N-Cadherina, E-Cadherina no funcional, actina alfa de músculo liso (alpha-SMA), Tenascina C y vimentina, junto con la expresión del receptor del factor de crecimiento transformante (TGF beta R1 y R2), consistente con subpoblaciones de MAFs reportadas in vivo. El análisis transcriptómico reveló una reversión de HS5-PC3 hacia un fenotipo metastásico con una regulación al alza en vías conocidas por regular la invasión, proliferación y angiogénesis del cáncer. La explotación de estos modelos 3D ingenierizados podría ayudar a desentrañar la nueva biología que regula el crecimiento metastásico y el papel que juegan los fibroblastos en el proceso de colonización.