Las técnicas moleculares independientes de la cultura han avanzado en la caracterización de muestras ambientales y humanas, incluido el bacterioma de la leche humana (HM). Sin embargo, la extracción de ADN genómico de alta calidad que sea representativo de la población bacteriana en las muestras es crucial. La eliminación de lípidos de la leche materna antes de la extracción de ADN es una práctica común, pero esto puede influir en la población bacteriana detectada. El objetivo de este estudio fue comparar cuatro kits comerciales de extracción de ADN y la eliminación de lípidos en relación con los perfiles bacterianos de la leche materna. Cuatro kits comerciales de extracción de ADN, QIAamp DNA Microbiome Kit, ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep(tm), QIAsymphony DSP DNA Kit y ZymoBIOMICS(tm) DNA Miniprep Kit, fueron evaluados utilizando leche recolectada de diez mujeres lactantes sanas. Los kits fueron evaluados en función de su capacidad para extraer altas cantidades de ADN puro de la leche materna y de cómo extraían el ADN de las comunidades bacterianas presentes en una comunidad microbiana simulada estándar comercial añadida a la leche materna. Finalmente, los kits fueron evaluados mediante la evaluación de su repetibilidad en la extracción. Los perfiles bacterianos fueron evaluados utilizando secuenciación Illumina MiSeq dirigida a la región V4 del gen 16S ARNr. Los kits ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep(tm) y ZymoBIOMICS(tm) DNA Miniprep (Zymo Research Corp., Irvine, CA, EE. UU.) extrajeron los rendimientos de ADN más altos con la mejor pureza. El ADN extraído con ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep(tm) representó mejor las bacterias en la comunidad simulada añadida a la leche materna. En muestras de leche materna no añadidas, el ADN extraído con el kit QIAsymphony DSP DNA mostró diferencias estadísticamente significativas en la prevalencia de taxones en comparación con el ADN extraído con los kits ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep(tm) y ZymoBIOMICS(tm) DNA Miniprep. La única diferencia entre la leche descremada y la entera se observa en los perfiles bacterianos con diferentes abundancias relativas de y . La extracción de ADN, pero no la eliminación de lípidos, influye sustancialmente en los perfiles bacterianos detectados en las muestras de leche materna, enfatizando la necesidad de una selección cuidadosa de un kit de extracción de ADN para mejorar la recuperación de ADN de una variedad de taxa bacterianos.