La alta complejidad de la microbiota oral de los perros sanos y la estrecha exposición de los humanos a los animales de compañía representan un riesgo de transmisión de microorganismos zoonóticos potenciales a los humanos, especialmente a través de mordeduras de perro, incluidos aquellos multirresistentes. No obstante, un número limitado de estudios exhaustivos se ha centrado en la diversidad de los microorganismos que habitan las cavidades orales de los perros sanos, particularmente basados en técnicas moleculares modernas. Investigamos organismos bacterianos y fúngicos en las cavidades orales de 100 perros sanos basándonos en una combinación de cultivo microbiológico convencional y selectivo, espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) y secuenciación de nueva generación. Además, se evaluaron los patrones de susceptibilidad antimicrobiana in vitro de los aislados y un gen de resistencia. Se aislaron un total de 213 bacterias y 20 hongos. (40/100 = 40%), alfa-hemolíticos (37/100 = 37%) y (22/100 = 22%) fueron las bacterias más prevalentes diagnosticadas por cultivo microbiológico y MALDI-TOF MS, mientras que (10/100 = 10%) fue el hongo más común identificado. Basado en la secuenciación de nueva generación de 20 perros muestreados, (32.5%), (16.3%), (12.8%), (9.5%), (5%), (3.8%) y (3.4%) géneros fueron prevalentes. Se observó una alta tasa de resistencia multirresistente en los aislados, particularmente a la azitromicina (19/19 = 100%), penicilina (15/19 = 78.9%) y sulfametoxazol/trimetoprim (15/19 = 78.9%). Además, se detectó el gen de resistencia en el 6.1% (3/49) de estafilococos coagulasa positivos. Aquí, destacamos la complejidad microbiana de la mucosa oral de los perros sanos, incluidos microorganismos zoonóticos potenciales y bacterias multirresistentes, contribuyendo con la investigación de la microbiota y los patrones de resistencia antimicrobiana de los microorganismos que habitan la cavidad oral de los perros sanos.