Los fenotipos ligados al sexo de plumaje tardío (LF) y plumaje temprano (EF) están controlados por un par de alelos. La autosexación basada en la tasa de plumaje se utiliza ampliamente en la producción avícola. Se informa que una duplicación en tándem de 176,324 pares de bases vinculada al locus es responsable de la expresión de LF y podría usarse como un marcador molecular para detectar pollos LF. Hasta ahora, no existe un método de genotipado que pueda identificar de manera precisa y estable el homocigoto y el heterocigoto LF en todas las razas de pollos. En el presente estudio, se desarrolló una prueba de PCR multiplex para identificar EF, homocigoto LF y heterocigoto de acuerdo con las bandas electroforéticas y la altura relativa de los picos mediante secuenciación Sanger. Probamos 413 pollos de seis razas nativas chinas con este método. La identificación fue consistente con los registros de sexo y fenotipo de los pollos. Se realizó un análisis de densidad de bandas, y los resultados respaldaron nuestro genotipado utilizando el nuevo ensayo. Para verificar aún más la precisión de esta prueba en la distinción entre machos homocigotos y heterocigotos, se emparejaron 152 machos LF con hembras EF, y los resultados de los fenotipos de la descendencia fueron consistentes con nuestras expectativas. Nuestros resultados respaldan la duplicación en tándem como marcadores moleculares de LF, y esta nueva prueba es aplicable a todos los pollos LF asociados con la duplicación en tándem.