La familia de genes WRKY está distribuida de manera ubicua en las plantas, cumpliendo funciones cruciales en las respuestas al estrés. Sin embargo, la organización estructural y la dinámica evolutiva de los genes WRKY en el algodón no se han elucidado completamente. En este estudio, se identificaron un total de 112, 119, 217 y 222 genes WRKY en , , , y , respectivamente. Estos 670 genes WRKY se categorizaron en siete subgrupos distintos y se distribuyeron de manera desigual a través de los cromosomas. El examen de motivos conservados, dominios, elementos de acción y la arquitectura genética destacó colectivamente la conservación y divergencia evolutiva dentro de la familia de genes WRKY en el algodón. El análisis de sinonimia y colinealidad confirmó además casos de expansión, duplicación y eventos de pérdida entre los genes WRKY durante la evolución del algodón. Además, los transgénicos mostraron tasas de germinación más altas y longitudes de raíz más largas bajo estrés por sequía y sal. El silenciamiento en el algodón llevó a niveles reducidos de ABA, prolina, POD y SOD, junto con la expresión regulada a la baja de genes responsables de la respuesta al estrés. Ensayos de levadura de un solo híbrido y de acoplamiento molecular confirmaron la capacidad de unión de GhWRKY31 al W box de , , y . Los hallazgos ofrecen colectivamente una visión sistemática y completa de los patrones evolutivos del algodón, proponiendo un marco regulador adecuado para desarrollar cultivares de algodón con una mayor resistencia al estrés por sequía y salinidad.