El tomate es un cultivo importante en Paraguay, donde proporciona una fuente de empleo e ingresos para los hogares. La producción de tomate puede ser afectada por nematodos de nudo en las raíces, especialmente spp. La identificación inequívoca de spp. en Paraguay aún no se ha realizado. Este estudio tiene como objetivo identificar especies en ocho distritos de producción de tomate de este país mediante técnicas bioquímicas y moleculares. Las hembras de spp. fueron extraídas de las raíces de tomate y caracterizadas utilizando fenotipos de isoenzimas de esterasa. Además, se extrajo ADN de los huevos de nematodos y se utilizaron SCARs (regiones amplificadas caracterizadas por secuencia) específicos de especies para confirmar el diagnóstico. Los nematodos fueron detectados en el 100% de las muestras estudiadas (prevalencia), de las cuales (Est: I2, Rm: 1.1;1.2) y (Est: J3, Rm: 1.0, 1.20, 1.35) estaban presentes en el 39.13% y 26.08% de las muestras, respectivamente. Una población (8.69%) de sp. que presentaba un perfil de esterasa atípico (Rm: 1.0 y 1.3) solo se detectó en el Distrito Julián Augusto Saldívar. Se observaron poblaciones mixtas, principalmente y , en el 26.08% de las muestras. Los cebadores SCAR incK14F/incK14R amplificaron fragmentos específicos para (399 pb) y (670 pb), confirmando los resultados enzimáticos. Aquí presentamos el primer estudio de identificación de nematodos de nudo en las raíces a nivel de especie en Paraguay.