El subtipo H9N2 de los virus de la influenza aviar de baja patogenicidad (LPAIV) es un patógeno generalizado en aves de corral que también puede infectar a los humanos. La caracterización de las infecciones virales es un proceso complejo que implica investigaciones clínicas, patológicas y virológicas. El objetivo de este estudio fue adaptar y optimizar una técnica inmunohistoquímica (IHC) desarrollada para LPAIV específicamente para la detección de antígenos del virus H9N2 en tejidos infectados. Pollos de engorde de veintiún días fueron inoculados con tres cepas diferentes del virus H9N2 por diferentes vías de infección (es decir, intranasal-intratraqueal e intravenosa) o coinfectados con el virus de la bronquitis infecciosa (IBV) y observados durante 11 días después de la infección. El protocolo de IHC sugerido fue modificado: (i) DAB (diaminobenzidina) fue sustituido por AEC (3-amino-9-etilcarbazol) como cromógeno; y (ii) se utilizaron reacciones inmunes indirectas en dos pasos de anticuerpos primarios monoclonales y anticuerpos secundarios anti-murinos marcados con peroxidasa en lugar de complejos de avidina-biotina. El antígeno del virus de la influenza aviar aparece como un precipitado rojo en los núcleos de las células afectadas, pero también puede ser identificado en el citoplasma. Se observaron hiperemia leve y congestión en la tráquea, saco aéreo y pulmones de las aves desafiadas, y se encontró exudado fibrinoso en la bifurcación en algunos casos. No se encontraron lesiones patológicas macroscópicas ni de IHC en el grupo de control. Usando el protocolo optimizado y un esquema de puntuación asociado, se demostró que las cepas de H9N2 probadas exhibieron tropismo respiratorio y del tracto urinario independientemente de la vía de inoculación. En el día 5, se detectó antígeno viral en el tracto respiratorio y en el riñón en el 30-50% de las muestras. En el día 11, no se observó señal de IHC, lo que indica la falta de replicación viral. Se encontraron ligeras diferencias en la expresión del antígeno viral entre las diferentes cepas del virus H9N2, pero, a diferencia de la influenza aviar altamente patogénica (HPAI), no se detectó antígeno viral en el cerebro y el páncreas. Por lo tanto, la IHC puede considerarse como una adición informativa y visual al conjunto de herramientas para la caracterización de infecciones por LPAIV H9N2.