La inhibición de enzimas metabólicas clave vinculadas a la diabetes tipo 2 (T2D) por compuestos derivados de alimentos es una estrategia emergente preventiva en el manejo de la T2D. Aquí, se evaluó el impacto de las fracciones de péptidos del queso Parmigiano-Reggiano (PR), en cuatro tiempos de maduración diferentes (12, 18, 24 y 30 meses), sobre la actividad enzimática de la alfa-glucosidasa, la alfa-amilasa y la dipeptidil peptidasa-IV (DPP-IV), así como sobre la formación de productos finales de glicación avanzada fluorescentes (fAGEs). Las fracciones de péptidos de PR fueron capaces de inhibir las enzimas seleccionadas y la formación de fAGEs. La muestra de PR de 12 meses de maduración fue la más activa contra las tres enzimas y los fAGEs. El análisis de espectrometría de masas permitió la identificación de 415 péptidos únicos, el 54.9% de ellos comunes a las cuatro muestras de PR. Se encontraron cuarenta y nueve péptidos bioactivos previamente identificados, caracterizados en su mayoría como inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina. La aplicación de un enfoque integrado que combinó peptidómica, análisis in silico y una relación estructura-actividad llevó a una selección eficiente de 6 péptidos con potenciales actividades inhibitorias de DPP-IV y alfa-glucosidasa. El péptido APFPE fue identificado como un potente nuevo inhibidor de DPP-IV (IC = 49.5 +/- 0.5 mol/L). Además, el conocido tripeptido antihipertensivo, IPP, fue el único capaz de inhibir las tres enzimas digestivas, destacando su posible nuevo y fundamental papel en el manejo de la diabetes.