La muerte regresiva de la nuez puede ser causada por varias especies patógenas fúngicas, que están asociadas con síntomas que van desde la muerte de ramas hasta la necrosis y el tizón de los frutos, desafiando el concepto de un patógeno-una enfermedad. Por lo tanto, una descripción precisa y extensa del patobioma fúngico de la nuez es crucial. Con este fin, la metabarcodificación de ADN representa un enfoque poderoso siempre que se evalúen los pipelines bioinformáticos para evitar interpretaciones erróneas. En este contexto, este estudio tuvo como objetivo determinar (i) el rendimiento de cinco pares de cebadores que apuntan a la región ITS en la amplificación de géneros de interés y la estimación de su abundancia relativa basada en comunidades simuladas y (ii) el grado de resolución taxonómica utilizando árboles filogenéticos. Además, nuestros pipelines también se aplicaron a secuencias de ADN de cáscaras y ramitas de nuez sintomáticas. En general, nuestros resultados mostraron que la región ITS2 era un mejor código de barras que ITS1 e ITS, resultando en valores de sensibilidad y/o similitud de composición significativamente más altos. El conjunto de cebadores ITS3/ITS4_KYO1 permitió cubrir un rango más amplio de diversidad fúngica, en comparación con los otros conjuntos de cebadores que también apuntan a la región ITS2, a saber, GTAA y GTAAm. Agregar un paso de extracción a la secuencia ITS2 influyó tanto positiva como negativamente en la resolución taxonómica a nivel de género y especie, dependiendo del par de cebadores considerado. En conjunto, estos resultados sugieren que el conjunto Kyo sin extracción de ITS2 fue el mejor pipeline para evaluar la diversidad fúngica más amplia, con una asignación taxonómica más precisa, en órganos de nuez con síntomas de muerte regresiva.