Los glicosaminoglicanos (GAGs) se consideran el tipo más difícil de glicoconjugados para analizar, ya que están constituidos por cadenas poliesacarídicas lineales largas con pesos moleculares que alcanzan varios millones de daltons. El análisis de abajo hacia arriba de los glicosaminoglicanos a partir de muestras biológicas es un procedimiento largo y laborioso debido a los muchos pasos de preparación involucrados. Además, hasta ahora, solo unos pocos artículos de investigación se han dedicado al análisis de GAGs mediante espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) porque su ionización intacta puede ser problemática debido a la presencia de grupos sulfato lábiles. En este trabajo, tuvimos como objetivo explorar el patrón de sulfatación de los disacáridos de condroitín/dermatán sulfato (CS/DS) monosulfatados en muestras de tejido humano porque representan la forma más abundante de sulfatación en disacáridos. Presentamos aquí una estrategia optimizada para analizar disacáridos CS/DS derivados en el objetivo a través de MALDI-TOF-MS utilizando un flujo de trabajo rápido que no requiere ninguna purificación después de la escisión enzimática. Por primera vez, mostramos que los experimentos MALDI-TOF/TOF permiten la discriminación entre isómeros de disacáridos CS monosulfatados a través de fragmentos específicos correspondientes a enlaces glicosídicos y a escisiones cruzadas. Este prueba de concepto se ilustra a través del análisis de disacáridos CS/DS de lesiones ateroscleróticas de diferentes orígenes histológicos, en las cuales pudimos identificar sus patrones de monosulfatación.