Los fibroblastos son células que residen en los tejidos conectivos fibrosos o lazos de la mayoría de los órganos mamíferos. Con fines de investigación, los fibroblastos a menudo se someten a cultivos a largo plazo bajo condiciones definidas, durante las cuales sus propiedades pueden cambiar significativamente. Es esencial comprender y documentar estos cambios para obtener resultados fiables. Para la cuantificación de expresiones génicas específicas, la técnica más fiable y ampliamente utilizada es la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Aquí, evaluamos el impacto de la estabilidad de un gen de referencia en un análisis de qRT-PCR de fibroblastos dérmicos caninos cultivados a largo plazo. Después de aislar con éxito los fibroblastos de los tejidos dérmicos caninos, se cultivaron y se evaluaron su proliferación y actividad de beta-galactosidasa en diferentes números de paso. Con el cultivo prolongado, los fibroblastos mostraron un largo tiempo de duplicación y una elevada actividad de beta-galactosidasa. Utilizando tres algoritmos ampliamente utilizados, geNorm, Normfinder y Bestkeeper, identificamos HPRT1, YWHAZ y GUSB como los genes de referencia más estables tanto para fibroblastos de paso temprano como tardío. Se encontró que los genes de referencia convencionales como GAPDH eran menos estables que esos genes. La normalización de Vimentina por los genes estables mostró diferencias estadísticas, mientras que la normalización por un gen inestable no lo hizo. En conjunto, este estudio indica que el uso de genes de referencia estables es esencial para medir de manera precisa y fiable la expresión génica tanto en fibroblastos de paso temprano como tardío. Estos hallazgos proporcionan valiosos conocimientos sobre controles internos para estudios de expresión génica y se espera que se utilicen para analizar patrones de expresión génica en la investigación en biología molecular.