El objetivo de este estudio fue identificar con un alto nivel de confianza los metabolitos previamente identificados como predictores de cojera y comprender su relevancia biológica mediante el análisis de vías. Para el sector de la ganadería lechera, la cojera es un gran desafío con un gran impacto en el bienestar animal y la economía de la granja. Comprender las alteraciones metabólicas durante el período de transición asociadas con la cojera antes de la aparición de signos clínicos puede permitir su detección temprana y la prevención de riesgos. La anotación con alta confianza de los metabolitos predictores de la cojera y la comprensión de las interacciones entre el metabolismo y la inmunidad son cruciales para una mejor comprensión de esta condición. Utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con estándares auténticos para aumentar la confianza en las anotaciones putativas de metabolitos previamente determinados como predictivos de la cojera en vacas lecheras en transición, fue posible identificar cresol, ácido valproico y gluconolactona como L1, L2 y L1, respectivamente, que son los niveles más altos de confianza en la identificación. El análisis de enriquecimiento del conjunto de metabolitos de las vías biológicas en las que están involucrados los predictores de la cojera identificó seis vías significativas (< 0.05). En comparación, el análisis de sobrerrepresentación y el análisis de topología identificaron dos vías significativas (< 0.05). En general, nuestro análisis de LC-MS/MS demostró ser adecuado para identificar con confianza metabolitos en muestras de orina que previamente se encontraron predictivos de la cojera y comprender su posible relevancia biológica, a pesar de los desafíos de identificación de metabolitos y análisis de vías al realizar metabolómica no dirigida. Este enfoque muestra potencial como un método confiable para identificar biomarcadores que se pueden utilizar en el futuro para predecir el riesgo de cojera antes del parto. Se requiere validación con una cohorte más grande para evaluar la generalización de estos hallazgos.