Las proteínas del esperma desempeñan roles vitales en la mejora de la resistencia al congelamiento del esperma en animales domésticos. Sin embargo, sigue estando poco definido qué proteínas regulan la resistencia al congelamiento de los espermatozoides en los carneros. Aquí, comparamos el proteoma del esperma de carnero con una alta tasa de recuperación tras la criopreservación (HCR) con el de carnero con una baja tasa de recuperación tras la criopreservación (LCR) utilizando un enfoque de proteómica cuantitativa basado en etiquetas de masa en tándem. Se realizó un análisis bioinformático para evaluar las proteínas expresadas diferencialmente (DEPs). Se identificaron un total de 2464 proteínas y se seleccionaron 184 DEPs. Setenta y dos proteínas fueron más altas en el grupo LCR. Ciento doce proteínas fueron más abundantes en el grupo HCR, y estaban principalmente involucradas en la regulación de la fosforilación oxidativa y las vías de termogénesis. Las proteínas en alta abundancia en el grupo HCR incluían la familia S100A, como S100A8, S100A9, S100A14 y S100A16, que controlan eficazmente el CA y mantienen la estructura de los flagelos; HYOU1 y PRDX1, que participan en la protección antioxidante y la anti-apoptosis para prevenir la muerte celular; y HSP90B1, que mantiene la actividad celular y la respuesta inmune. Nuestros resultados podrían ayudar a iluminar los mecanismos moleculares subyacentes a la criopreservación del semen de carnero y expandir la dirección potencial de la criopreservación de semen de alta calidad.