Se están desarrollando programas efectivos de conservación de felinos salvajes con tecnologías de reproducción asistida en diferentes partes del mundo. El gato de cabeza plana, el gato pescador y el gato dorado asiático son tres especies entre nueve felinos salvajes en Tailandia que necesitan esfuerzos urgentes de conservación. Aquí, evaluamos las características rutinarias del esperma y reportamos la detección de biomarcadores proteicos relacionados con el proceso de fertilización, IZUMO1 y la familia CRISP, así como marcadores apoptóticos, caspasa-3 activa o cortada, en muestras de semen recolectadas de estos felinos salvajes. IZUMO1 se localizó en el segmento ecuatorial de la cabeza del esperma, que es la región involucrada en la interacción de gametos. Los niveles más altos de IZUMO1 se encontraron tanto en el pellet de esperma como en el plasma seminal del gato de cabeza plana, según lo determinado por inmunoblotting. CRISP2, una proteína que ayuda en la fusión esperma-huevo, y CRISP3 se encontraron tanto en el pellet de esperma como en el plasma seminal, y los niveles más altos se observaron en el gato pescador. También se demostraron correlaciones positivas entre ciertos parámetros del semen y la expresión de IZUMO1, CRISP2 y CRISP3. La caspasa-3 cortada se encontró en todas las muestras de esperma en las tres especies y se asoció con un aumento en la fragmentación del ADN y una disminución en ciertas características del semen, como la motilidad, la viabilidad y los acrosomas intactos. Nuestros resultados sugieren que el análisis de IZUMO1, la familia CRISP y la caspasa-3 cortada, junto con las características rutinarias del esperma, pueden permitir un mejor éxito en la gestión de la cría en felinos salvajes, particularmente en el gato de cabeza plana y el gato pescador.