La mastitis es un proceso inflamatorio del tejido de la ubre causado principalmente por la bacteria Staphylococcus aureus. El uso indiscriminado de antibióticos propicia la selección de microorganismos resistentes, suprimiendo a la vez las formas susceptibles, lo que causa un grave problema en el ganado lechero. Dada la importancia de realizar un antibiograma para seleccionar la terapia antimicrobiana más adecuada, el objetivo de este estudio fue identificar bacterias aisladas de leche de vaca con mastitis, en granjas lecheras ubicadas en la ciudad de Pelotas, Rio Grande do Sul, y determinar el perfil de susceptibilidad de estos aislamientos a los antibióticos utilizados para tratar esta enfermedad. Se seleccionaron 30 aislamientos de Staphylococcus spp. de muestras de leche de los cuartos de ubre con mastitis subclínica, cuyas especies se identificaron mediante el sistema Vitek. El perfil de susceptibilidad se determinó mediante el ensayo de difusión en disco contra: ampicilina, amoxicilina, bacitracina, cefalexina, ceftiofur, enrofloxacino, gentamicina, neomicina, norfloxacino, penicilina G, tetraciclina y trimetoprima. En el antibiograma, el 100,0% de los aislamientos fueron resistentes a trimetoprima y el 96,7% a tetraciclina y neomicina. Tres cepas de Staphylococcus spp. (10,0%) presentaron resistencia a los 12 antibióticos evaluados y 24 (80,0%) a al menos ocho. Estos resultados mostraron la dificultad en el tratamiento de la mastitis debido a la resistencia de los patógenos.