La chaperona HSP90C, localizada en el estroma de los plastidios, desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la proteostasis óptima dentro de los cloroplastos y participa en los procesos de translocación de proteínas. Si bien los estudios existentes han revelado la interacción directa de HSP90C con el pre-proteína cliente dependiente de la translocasa Sec, PsbO1, y la subunidad SecY1 del sistema de canal de translocasa Sec1 unido a la membrana tilacoide, su participación directa con la subunidad homodimérica extrínseca de la translocasa Sec, SecA1, sigue siendo elusiva. Empleando un ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) y otros análisis in vitro, desentrañamos interacciones potenciales entre HSP90C y SecA1. Nuestra investigación reveló interacciones dinámicas entre HSP90C y SecA1 en la membrana tilacoide y el estroma. La localización de esta interacción en la membrana tilacoide dependía de la actividad ATPasa activa de HSP90C, mientras que su interacción en el estroma estaba asociada con la actividad ATPasa activa de SecA1. Además, observamos una interacción directa entre estas dos proteínas al analizar sus actividades de hidrólisis de ATP, y su interacción probablemente impacta en sus respectivos ciclos funcionales. Adicionalmente, utilizando PsbO1, un modelo de pre-proteína cliente de la translocasa Sec, estudiamos las complejidades de la posible participación de HSP90C en la translocación de pre-proteínas a través del sistema Sec1 en cloroplastos. Los resultados sugieren una naturaleza compleja de la interacción HSP90C-SecA1, posiblemente mediada por la proteína cliente Sec. Nuestros estudios arrojan luz sobre los aspectos matizados del compromiso de HSP90C en la orquestación de la translocación de pre-proteínas, y proponemos un posible papel colaborativo de HSP90C con SecA1 en la facilitación activa del transporte de pre-proteínas a través de la membrana tilacoide.