Una característica del interferón antiviral de ARN (RNAi) es la producción de ARN pequeños interferentes virales (vsiRNA). El perfil de los vsiRNAs indica que ciertas regiones del genoma del ARN viral o del ARN viral transcrito, denominadas puntos calientes de vsiRNA, son más propensas a la escisión mediada por RNAi para la biogénesis de vsiRNA. Sin embargo, la relevancia biológica de los vsiRNAs de puntos calientes para la defensa innata del hospedador contra patógenos aún debe ser elucidada. Aquí, mostramos que la orientación directa a un punto caliente mediante un vsiRNA sintético confiere resistencia del hospedador a la infección viral. Utilizando blotting de Northern y RNAseq, obtuvimos un perfil de vsiRNAs del virus del mosaico de la yuca africana (ACMV), un virus de ADN de cadena simple. Se sintetizaron cadenas de sentido y anti-sentido de pequeños ARN correspondientes a un punto caliente y un punto frío de vsiRNA. La co-inoculación con el siRNA de punto caliente de doble cadena protegió a las plantas de la infección por ACMV, donde la replicación del ADN viral y la acumulación de ARN mensajero viral fueron indetectables. La cadena de sentido o anti-sentido de este vsiRNA de punto caliente, y el vsiRNA de punto frío en formatos de doble cadena y de cadena simple no poseían actividad en la protección viral. Además, demostramos que la resistencia viral mediada por el vsiRNA de punto caliente tenía un efecto umbral y requería una actividad activa. Estos datos muestran que los vsiRNAs de puntos calientes tienen una importancia funcional en el RNAi antiviral, sugiriendo que pueden tener el potencial como agente de protección exógeno para controlar enfermedades virales destructivas en las plantas.