Este estudio tuvo como objetivo evaluar la citotoxicidad y las propiedades microbiológicas de los hidrogeles de poli (N-vinilcaprolactama)-PNVCL que contienen flavonoides como medicación intracanal para la terapia endodóntica. La actividad antimicrobiana de la ampelopsina (AMP), isoquercitrina y rutina se determinó contra varias bacterias mediante el método de microdilución. Después de la síntesis y caracterización por reología, los hidrogeles de PNVCL se cargaron con AMP y controles de hidróxido de calcio (CH) y clorhexidina (CHX), y se determinó el perfil de liberación de los compuestos. PNVCL+AMP, PNVCL+CH, PNVCL+CHX se evaluaron en biopelículas de múltiples especies y se analizaron mediante Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y Microscopía Confocal de Barrido Láser (CLSM). La citotoxicidad se determinó después de la exposición de fibroblastos a diluciones seriadas de AMP y extractos de hidrogel de PNVCL. AMP fue efectivo contra todas las bacterias probadas, especialmente contra algunas específicas. El análisis de SEM y CLSM mostró que PNVCL + AMP causó una disminución significativa y desorganización de las biopelículas de múltiples especies y reducción de células viables intracanal, superior a los otros grupos. AMP afectó la viabilidad de los fibroblastos a concentraciones superiores a 0.125 mg/mL, y los extractos de PNVCL+AMP mostraron baja citotoxicidad. En conclusión, PNVCL que contiene AMP demostró citocompatibilidad y un efecto potente contra biopelículas de múltiples especies y podría ser una medicación intracanal potencial para fines endodónticos.