La fibroína de seda se considera un biomaterial prometedor en diversas áreas, incluida la regeneración del tejido óseo. En este estudio, se introdujo Laponite (LAP), que puede promover la diferenciación osteogénica, en la fibroína de seda regenerada (RSF) para preparar un hidrogel híbrido RSF/LAP. Este hidrogel tixotrópico es inyectable durante el proceso de operación, lo que es favorable para reparar defectos óseos. Nuestro trabajo anterior demostró que el hidrogel RSF/LAP promovió en gran medida la diferenciación osteogénica de los osteoblastos in vitro. En el presente estudio, se encontró que el hidrogel RSF/LAP tiene una excelente biocompatibilidad y mejora significativamente la formación de nuevo hueso en un modelo estándar de defecto calvarial en ratas in vivo. Además, se exploró extensamente el mecanismo biológico subyacente del hidrogel RSF/LAP en la promoción de la diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimatosas de médula ósea (BMSCs). Los resultados indican que los hidrogeles RSF/LAP proporcionan condiciones adecuadas para la adhesión y proliferación de BMSCs, mostrando buena biocompatibilidad in vitro. Con el aumento en el contenido de LAP, la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) y la expresión de ARNm y proteínas de los marcadores osteogénicos de BMSCs mejoraron significativamente. Se encontró que la activación de la vía de la proteína quinasa B (AKT) es responsable de las propiedades osteogénicas inherentes del hidrogel híbrido RSF/LAP. Por lo tanto, los resultados mostrados en este estudio sugieren firmemente que un hidrogel RSF/LAP inyectable con buena biocompatibilidad (tanto in vitro como in vivo) tendría buenas perspectivas de aplicación en el campo de la regeneración ósea.