El refinamiento de los procedimientos experimentales en la investigación animal tiene como objetivo prevenir y minimizar el dolor/estrés en los animales, incluido el período de eutanasia. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el dolor asociado con seis métodos de eutanasia en ratas Wistar (inyectable, inhalatorio y físico), aplicando la Escala de Muecas de Ratas (RGS), comparando las puntuaciones y determinando el método con la puntuación más alta que podría indicar dolor en roedores de laboratorio. Se utilizaron sesenta ratas Wistar machos y hembras adultas y se asignaron a seis tratamientos: pentobarbital, CO, decapitación, isoflurano, ketamina + xilazina y ketamina + CO. Se realizó grabación en video para evaluar las puntuaciones de RGS en cuatro eventos: basal: 24 h antes del procedimiento; Ti: tres minutos antes del procedimiento; Ti: durante la aplicación del método de eutanasia; y Ti: inmediatamente después de la aplicación hasta LORR. Los principales hallazgos de este estudio mostraron que, durante Ti, la decapitación y la ketamina + xilazina tuvieron las puntuaciones más altas (0.6 +/- 0.26 y 0.6 +/- 0.16, respectivamente) (< 0.0001), mientras que en Ti, el CO (0.9 +/- 0.18) y el isoflurano (1.2 +/- 0.20) registraron las puntuaciones más altas (< 0.0001). Según los resultados presentes, la decapitación y la ketamina + xilazina provocaron dolor agudo a corto plazo, posiblemente debido al daño tisular causado por ambos métodos (inyección y guillotina). En contraste, las puntuaciones de RGS del isoflurano registradas durante Ti podrían estar asociadas con nocicepción/dolor debido a la pungencia del fármaco o al efecto relajante muscular farmacológico del isoflurano. Se necesita más investigación para establecer un estudio integral del dolor durante la eutanasia, donde la RGS podría utilizarse teniendo en cuenta las limitaciones que los anestésicos podrían tener sobre la expresión facial.