Genotipado de alto rendimiento de células editadas con CRISPR/Cas en placas de 96 pocillos
Autores: Nussbaum, Lea; Telenius, Jelena M.; Hill, Stephanie; Hirschfeld, Priscila P.; Suciu, Maria C.; , ; Downes, Damien J.; Hughes, Jim R.
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2018
Acceso abierto
Artículo científico
2018
Genotipado de alto rendimiento de células editadas con CRISPR/Cas en placas de 96 pocillos
Categoría
Ingeniería y Tecnología
Subcategoría
Bioingeniería
Palabras clave
Tecnologías de edición de ADN
Nucleasas de dedos de zinc
Talen
Enzimas de la familia crispr/cas
Editores de base
Reparación dependiente de homología.
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 26
Citaciones: Sin citaciones
El surgimiento en los últimos años de tecnologías de edición de ADN, como las nucleasas de dedo de zinc (ZFNs), las nucleasas guiadas por activadores de la transcripción (TALENs), las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/enzimas de la familia Cas, y los editores de bases, ha aumentado enormemente nuestra capacidad para generar cientos de células editadas que llevan una variedad de alelos, incluidas las sustituciones de un solo nucleótido. Sin embargo, la poca frecuencia de la reparación dependiente de la homología (HDR, por sus siglas en inglés) en la generación de estas sustituciones en general requiere el cribado de un gran número de células editadas para aislar el cambio de secuencia de interés. Aquí presentamos un método de alto rendimiento para la amplificación y codificación de loci editados en un formato de placa de 96 pocillos. Después de la codificación, las placas se indexan en grupos que permiten la secuenciación multiplexada de cientos de clones simultáneamente. Este protocolo funciona con una alta tasa de éxito, con más del 94% de los clones genotipados con éxito después del análisis.
Descripción
El surgimiento en los últimos años de tecnologías de edición de ADN, como las nucleasas de dedo de zinc (ZFNs), las nucleasas guiadas por activadores de la transcripción (TALENs), las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/enzimas de la familia Cas, y los editores de bases, ha aumentado enormemente nuestra capacidad para generar cientos de células editadas que llevan una variedad de alelos, incluidas las sustituciones de un solo nucleótido. Sin embargo, la poca frecuencia de la reparación dependiente de la homología (HDR, por sus siglas en inglés) en la generación de estas sustituciones en general requiere el cribado de un gran número de células editadas para aislar el cambio de secuencia de interés. Aquí presentamos un método de alto rendimiento para la amplificación y codificación de loci editados en un formato de placa de 96 pocillos. Después de la codificación, las placas se indexan en grupos que permiten la secuenciación multiplexada de cientos de clones simultáneamente. Este protocolo funciona con una alta tasa de éxito, con más del 94% de los clones genotipados con éxito después del análisis.