La espinaca (L.), un vegetal denso en nutrientes consumido a nivel mundial, contiene diversas vitaminas y minerales. Sin embargo, las temperaturas elevadas pueden limitar el rendimiento al interrumpir el desarrollo de las hojas y la eficiencia fotosintética. La familia de factores de terminación de transcripción mitocondrial (mTERF), que regula la expresión génica organelar, desempeña roles cruciales en el crecimiento de las plantas y la regulación fotosintética. Por lo tanto, la caracterización de la familia mTERF de la espinaca (SomTERF) es crítica para elucidar los mecanismos de termotolerancia en este cultivo. En este estudio, identificamos sistemáticamente 31 genes del genoma de la espinaca, que están distribuidos en cinco cromosomas y nueve andamios genómicos no ensamblados. Las predicciones de localización subcelular indicaron que estas proteínas se dirigen predominantemente a los cloroplastos y mitocondrias. Los análisis de dominios conservados confirmaron que todas las proteínas SomTERF poseen dominios mTERF canónicos y diez motivos conservados. El agrupamiento filogenético segregó estas proteínas en nueve subgrupos distintos (I-IX), con una divergencia significativa observada en el número de copias de genes entre los subgrupos. El cribado de elementos cis identificó una abundancia de motivos responsivos al calor, al frío y a hormonas dentro de las regiones promotoras. Notablemente, siete miembros (incluyendo) mostraron un enriquecimiento pronunciado de elementos de choque térmico (HSEs). El perfil de expresión específico de órganos reveló una expresión preferencial en las hojas de estos siete genes. La RT-qPCR comparativa en cultivares sensibles al calor (Sp73) y tolerantes al calor (Sp75) bajo estrés térmico demostró dinámicas de expresión dependientes del genotipo. La validación funcional se logró mediante clonación, y la sobreexpresión transgénica mostró una termotolerancia significativamente mejorada, como lo evidencian las tasas de supervivencia mejoradas tras el tratamiento térmico. Ensayos de dos híbridos de levadura (Y2H) revelaron además una interacción física entre SomTERF5 y SopTAC2. Este estudio proporciona una base integral para comprender la regulación del desarrollo mediada por mTERF y estrategias avanzadas de cría molecular para desarrollar variedades de espinaca resistentes al calor.