El pimiento (L.) es un vegetal consumido en todo el mundo, utilizado principalmente para la ingesta de vitamina C y como condimento. El ascorbato (Asc) es un metabolito multifuncional, que actúa como antioxidante y cofactor enzimático involucrado en múltiples procesos celulares. Sin embargo, no hay evidencia sobre la contribución de las vías de biosíntesis y los mecanismos regulatorios responsables de las reservas de Asc en las plantas de pimiento. Aquí, presentamos una investigación a nivel de genoma y transcriptoma de los genes responsables de la biosíntesis de Asc en el pimiento durante el desarrollo del fruto, estrés y exposiciones a fitohormonas. Se anotaron un total de 21 genes, dispersos en diez de los doce cromosomas del pimiento. Los análisis de expresión génica de nueve experimentos transcriptómicos respaldaron el papel principal de la vía del L-galactosa en el proceso de biosíntesis de Asc, dado su perfil de expresión constitutivo, ubicuo y alto observado en todas las condiciones estudiadas. Sin embargo, los genes de vías alternativas generalmente mostraron baja expresión o no se expresaron y parecieron desempeñar un papel secundario bajo condiciones de estrés específicas y tratamientos con fitohormonas. En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan una comprensión espaciotemporal más profunda de los niveles de expresión de los genes involucrados en la biosíntesis de Asc, y destacan a los miembros de la vía del L-galactosa como candidatos prometedores para futuras experimentaciones en húmedo, abordando el aumento del contenido de ascorbato en pimientos y otros cultivos.