La caffeoil coenzima A-O-metiltransferasa (CCoAOMT) tiene una función crítica en la vía de biosíntesis de la lignina. Sin embargo, sus funciones en el algodón no están claras. En esta investigación, observamos 50 genes de cuatro especies de algodón, incluyendo dos diploides y dos tetraploides, realizamos un análisis bioinformático y nos centramos en la participación y funciones de CCoAOMT en la síntesis de lignina. Las proteínas CCoAOMT se dividieron en cuatro subgrupos basados en el análisis del árbol filogenético. El análisis de motivos reveló que todas las proteínas CCoAOMT poseen dominios conservados Methyltransf_3, y se identificaron características estructurales conservadas basadas en la organización de exones e intrones de los genes. Un análisis de sinonimia sugirió que las duplicaciones segmentarias fueron la causa principal de la expansión de la familia de genes. El análisis de datos transcriptómicos reveló que CCoAOMT1, CCoAOMT2 y CCoAOMT3 estaban altamente expresados en los tallos. Los experimentos de localización subcelular de CCoAOMT1, CCoAOMT2 y CCoAOMT3 mostraron que estaban localizados en el núcleo y la membrana plasmática. Sin embargo, no hay elementos reguladores relacionados con la síntesis de lignina en el promotor del gen. La expresión de CCoAOMT fue inhibida por la tecnología de silenciamiento génico inducido por virus para obtener líneas de silenciamiento génico; la supresión de la expresión resultó en una reducción del 56% en el contenido de lignina en los tallos de algodón, y el área de tinción con floroglucinol correspondiente al xilema se redujo significativamente, indicando que CCoAOMT regula positivamente la síntesis de lignina. Nuestros resultados proporcionaron información fundamental sobre CCoAOMT y destacaron sus funciones potenciales en la biosíntesis de lignina y lignificación en el algodón.