El cacahuete es un cultivo comercial vital a nivel mundial, y mejorar su contenido de proteína en la semilla es esencial para la seguridad nutricional. Sin embargo, la base genética del contenido de proteína en la semilla de cacahuete sigue siendo desconocida. En este estudio, se empleó el análisis de segregantes agrupados combinado con secuenciación de próxima generación (BSA-Seq) para aislar un gen candidato asociado con el contenido de proteína en la semilla de cacahuete. Su función fue luego caracterizada a través de la eliminación génica mediada por CRISPR/Cas9 y análisis de sobreexpresión. La edición genética del gen homólogo en redujo significativamente el contenido de proteína en la semilla en seis líneas, mientras que dos líneas no mostraron cambios evidentes. La sobreexpresión del gen en llevó a un aumento en el contenido de proteína en la semilla en tres líneas transgénicas, pero algunas líneas no mostraron cambios significativos, o incluso una disminución. Estos resultados inconsistentes podrían atribuirse a la redundancia funcional, modificaciones epigenéticas, competencia de recursos o mecanismos de regulación de retroalimentación dentro de la vía de síntesis de proteínas. Este estudio proporciona información sobre los mecanismos moleculares de la regulación del contenido de proteína en la semilla de cacahuete y ofrece un potencial objetivo genético para la crianza molecular.