Los modelos de músculo esquelético creados in vitro son esenciales para evaluar de manera eficiente la seguridad y eficacia de los medicamentos. Sin embargo, los sustratos de cultivo convencionales no replican adecuadamente las características físicas del músculo nativo y no permiten un cultivo a largo plazo, lo que limita la madurez del tejido. Los hidrogeles de gelatina moldeados en micromoldes y entrecruzados con transglutaminasa microbiana (hidrogeles de gelatina-MTG) han demostrado previamente inducir la alineación de los miotubos C21C2 y mejorar la longevidad del cultivo. Sin embargo, varias propiedades de los hidrogeles de gelatina-MTG no han sido caracterizadas sistemáticamente, como los cambios en el módulo elástico durante la incubación en condiciones similares a las de cultivo y su capacidad para favorecer la maduración del sarcómero. En este estudio, se fabricaron varios hidrogeles de gelatina-MTG que se incubaron en condiciones ambientales o similares a las de cultivo. Se midieron el módulo elástico, la masa y la transmitancia durante un período de una o dos semanas. En comparación con los hidrogeles en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o en aire ambiente, los hidrogeles en Medio Águila Modificado de Dulbecco (DMEM) y 5% de CO demostraron tener el módulo elástico más estable. Un subconjunto de hidrogeles de gelatina-MTG fue moldeado en micromoldes y sembrado con mioblastos C2C12 o de pollo primarios, los cuales se alinearon y fusionaron en miotubos multinucleados con sarcómeros relativamente maduros. Estos datos son importantes para fabricar hidrogeles de gelatina-MTG con propiedades mecánicas predecibles y estables, y resaltar sus ventajas como sustratos de cultivo para la ingeniería de tejidos musculares relativamente maduros y estables.