Los sistemas de ordeño automatizado se están adoptando cada vez más para la producción de vacas lecheras, promoviendo una gestión individualizada de las vacas dependiendo de factores como la etapa de lactancia, la edad y la productividad. El objetivo del estudio fue investigar los efectos de la frecuencia de ordeño en la lactancia temprana en vacas ordeñadas a través de AMS. Vacas Holstein multiparas bloqueadas por paridad y fecha de parto fueron asignadas aleatoriamente a tratamientos (n = 8 por tratamiento): tres o seis ordeños por día. La fase experimental se definió como de 4 a 29 días en leche. Los ajustes de AMS se programaron para que las vacas 3X estuvieran limitadas a tres ordeños por día, mientras que las vacas 6X podían tener seis ordeños por día. Después fue la fase de continuidad que abarcó de 30 a 90 días en leche; todas las vacas pudieron tener hasta seis ordeños por día. Las mediciones realizadas por el AMS incluyeron peso corporal, producción de leche y consumo de pellets. Se analizaron muestras de leche compuestas semanalmente para determinar la composición de macronutrientes y el perfil de ácidos grasos. Se tomó sangre del coxis en 3, 8 +/- 1 y 13 +/- 1 días en leche; se cuantificaron las concentraciones de los analitos en el plasma sanguíneo. Se logró una mayor cantidad de ordeños por día para las vacas 6X en comparación con las vacas 3X durante la fase experimental, pero similar durante la fase de continuidad. La producción diaria de leche no fue separable durante la fase experimental, mientras que las vacas 6X en su tercer grupo de lactancia o mayor tuvieron una mayor producción de leche que las vacas 3X del mismo grupo durante la fase de continuidad. El contenido de grasa en la leche y la producción de leche corregida al 4% de grasa fueron ambos mayores para las vacas 6X, 3 + grupo de lactancia durante la fase experimental en comparación con las vacas 3X, 3 + grupo de lactancia. Las proporciones de ésteres metílicos de ácidos grasos en la leche fueron diferentes entre los grupos de ordeños por día, siendo las vacas 6X, 3 + grupo de lactancia las que presentaron la menor cantidad de ácidos grasos de cadena corta y par de origen de novo o post-absortivo. Las diferencias en los analitos indicaron que las vacas 6X, 3 + grupo de lactancia experimentaron estrés metabólico e incorporaron mayores cantidades de ácidos grasos del tejido adiposo. Una mayor frecuencia de ordeño en la lactancia temprana en AMS puede cambiar la partición de nutrientes en las vacas para apoyar una mayor producción en vacas de 3 o más partos.