La expresión génica en células eucariotas puede estar gobernada por variantes de histonas, que reemplazan a las histonas acopladas a la replicación, confiriendo propiedades únicas a la cromatina. MacroH2A1 es una variante de histona H2A que contiene un dominio muy similar a H2A y un gran dominio no histónico (macro). MacroH2A1, a su vez, está presente en dos isoformas alternadamente empalmadas: macroH2A1.1 y macroH2A1.2, que regulan la plasticidad y proliferación celular de manera notablemente distinta. Las colas N-terminal y C-terminal de las histonas H2A provienen de la estructura del núcleo del nucleosoma y pueden ser sitios de destino para varias modificaciones post-traduccionales (PTMs). Las isoformas macroH2A1.1 y macroH2A1.2 difieren solo en unos pocos aminoácidos y en su capacidad para unirse a metabolitos derivados de NAD, una propiedad que supuestamente confiere sus diferentes funciones in vivo. Algunas de las modificaciones en la variante macroH2A1 han sido identificadas, como la fosforilación (T129, S138) y la metilación (K18, K123, K239). Sin embargo, ningún estudio, hasta donde sabemos, ha analizado extensamente y en paralelo, el patrón de PTM de macroH2A1.1 y macroH2A1.2 en el mismo entorno experimental, lo que podría facilitar la comprensión de sus distintas funciones biológicas en la salud y la enfermedad. Utilizamos un enfoque basado en espectrometría de masas para identificar los sitios de fosforilación, acetilación y metilación en macroH2A1.1 y macroH2A1.2 etiquetados con proteína verde fluorescente (GFP) expresados en células de hepatoma humano. El impacto de las PTMs seleccionadas en la estructura y función de macroH2A1.1 y macroH2A1.2 se demuestra utilizando análisis computacionales. Identificamos K7 como un nuevo sitio de acetilación en ambas isoformas de macroH2A1. La comparación cuantitativa de las marcas de histonas entre las dos isoformas reveló diferencias significativas en los niveles de T129 y S170 fosforilados. Nuestro análisis computacional proporcionó evidencia de que el estado de fosforilación en la región de enlace intrínsecamente desordenada en las isoformas de macroH2A1 podría representar un elemento regulador clave que contribuye a sus distintas respuestas biológicas. En conjunto, nuestros resultados informan sobre diferentes PTMs en las dos isoformas de empalme de macroH2A1 como responsables de sus características y distribución distintas en la célula.