Aunque las culturas de células cancerosas en 2D se han utilizado durante décadas como una herramienta de investigación de primera línea para investigar fármacos y tratamientos antitumorales, su uso presenta muchos inconvenientes, incluida la escasa semejanza de dichas culturas con las características de los tumores in vivo. Para mitigar estos inconvenientes, han surgido modelos de cultivo en 3D como una alternativa más representativa. Las células cancerosas cultivadas como estructuras en 3D tienen la ventaja de parecerse a los tumores sólidos en su arquitectura y en su resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, en parte debido a la limitada penetración de los fármacos. Además, estas estructuras en 3D crean un entorno más fisiológico para el estudio de la invasión y migración de las células inmunitarias, comparable a los tumores sólidos. En este artículo, describimos un protocolo paso a paso rápido y rentable para la generación de esferoides en 3D utilizando placas multiwell de ultra-baja adherencia (ULA), que se pueden incorporar al flujo de trabajo normal de cualquier laboratorio. Utilizando este protocolo, se pueden obtener esferoides de diferentes líneas celulares de cáncer humano y luego caracterizarlos en función de su morfología, viabilidad y expresión de marcadores específicos.