La expresión de resistencia a insectos del algodón (Bt) es inestable debido a variaciones temporales y espaciales en el contenido de proteína Bt en diferentes órganos y etapas de crecimiento. El objetivo de este estudio fue mejorar el contenido de proteína Bt en las flores de algodón e investigar el mecanismo fisiológico subyacente utilizando métodos analíticos bioquímicos. En este estudio, se utilizó un diseño de parcelas divididas con tres repeticiones. Las parcelas principales incluyeron dos cultivares de algodón Bt (un cultivar convencional, Sikang1 (S1), y un cultivar híbrido, Sikang3 (S3)), mientras que cinco niveles de aplicación de nitrógeno en el suelo (CK (control check): nivel normal; N1: 125% de CK; N2: 150% de CK; N3: 175% de CK; N4: 200% de CK) constituyeron las subparcelas. Se midieron el contenido de proteína Bt y los parámetros relacionados con el metabolismo del nitrógeno. Encontramos que el contenido de proteína Bt aumentó y luego disminuyó con el aumento de las tasas de nitrógeno. Alcanzó su máximo en N3, con aumentos significativos del 71,86% en 2021 y del 39,36% en 2022 en comparación con CK. El análisis de correlación indicó que el contenido de proteína Bt estaba significativamente relacionado de manera positiva con los contenidos de proteína soluble y aminoácidos libres, así como con las actividades de GPT (glutámico pirúvico transaminasa), GOT (glutámico oxaloacético transaminasa), GS (glutamina sintetasa) y GOGAT (glutamato sintetasa). Por otro lado, se encontraron correlaciones negativas entre el contenido de proteína Bt y las actividades de proteasas y peptidasas. Además, el análisis de regresión paso a paso y de senda indicó que el aumento en el contenido de proteína Bt se debió principalmente al aumento de las actividades de GS y GOGAT. En resumen, aumentar apropiadamente la aplicación de fertilizantes nitrogenados es una forma práctica de aumentar el contenido de proteína Bt en las flores y la eficacia insecticida del algodón Bt. Estos hallazgos proporcionan una estrategia agronómica viable para mantener la expresión de Bt durante el período crítico de floración.