Grandes cantidades de sustrato de setas gastado (SMS) se producen a nivel mundial, pero su eficiencia de utilización es baja, lo que conlleva impactos ambientales negativos, como la contaminación del agua, el suelo y el aire. SMS contiene nutrientes, como proteínas celulares, con una posible aplicación en la alimentación animal. Sin embargo, la lignocelulosa en SMS restringe la digestión y absorción animal, lo que dificulta su aplicación en la nutrición animal. Investigamos el potencial de la celulasa, xilanasa, beta-galactosidasa y una variedad de microorganismos para optimizar las condiciones de producción de azúcares reductores (RS) y la tasa de degradación de las fibras detergentes neutras. Los resultados mostraron que la proporción óptima de múltiples enzimas para la producción de glucosa de hasta 210.89 mg/g fue del 10% de celulasa, 10% de xilanasa y 2% de beta-galactosidasa, a 50 grados Celsius y 60% de humedad durante una duración de hidrólisis de 20 h. Para mejorar la combinación óptima de enzimólisis, experimentos de co-fermentación con múltiples microorganismos y enzimas mostraron que la inoculación con 10%, 2% y 2%, en combinación con 10% de celulasa, 10% de xilanasa, 2% de beta-galactosidasa y 1% de urea, a 36.8 grados Celsius y 59% de humedad durante 70 h de hidrólisis, podría llevar a una tasa de degradación del 23.69% de las fibras detergentes neutras. Este proceso aumentó significativamente la tasa de degradación de las fibras detergentes neutras y el contenido de nutrientes en comparación con las condiciones de fermentación iniciales. En general, nuestro estudio generó condiciones óptimas de co-fermentación para bacterias y enzimas y proporciona una referencia práctica para la síntesis biológica de piensos utilizando sustrato de setas gastado.