En este estudio, se utilizaron cuatro métodos (protocolo de fenol-cloroformo, kit de yoduro de sodio, QIAamp DNA Blood Mini Kit y TIANamp Micro DNA Kit) para extraer ADN libre de células (cfDNA) de la sangre de ganado, y el rendimiento y la pureza del cfDNA variaron en los cuatro métodos diferentes de 0.36 a 0.84 ng/mL para el rendimiento y de 0.67 a 1.80 (A260/A280) para la pureza. En comparación con otros métodos, el kit TIANamp Micro DNA tuvo un mejor rendimiento tanto en cantidad de cfDNA como en pureza (0.05); además, los niveles de cfDNA en sangre aumentaron significativamente en vacas lecheras Holstein bajo la influencia del estrés térmico (< 0.01) y la mastitis (< 0.0001), lo que mostró un potencial para discriminar la mastitis (AUC = 0.99, IC del 95% = 0.97 a 1.00) o el estrés térmico (AUC = 0.86, IC del 95% = 0.73 a 0.98) en las vacas. En resumen, establecimos un sistema experimental completo para la extracción de cfDNA de la sangre de ganado basado en el método de alto rendimiento del TIANamp Micro DNA Kit y mostramos el efecto de la mastitis y el estrés térmico en los niveles de cfDNA en la sangre de ganado por primera vez. Nuestros hallazgos sugieren que el cfDNA en la sangre de ganado puede ser un marcador útil para medir la mastitis y el estrés térmico en el ganado lechero.