Este protocolo de extracción diferencial detalla los pasos para aislar ADN de almohadillas de muestra utilizadas en pruebas inmunocromatográficas de flujo lateral (LFI), particularmente en casos que involucran muestras biológicas mixtas como semen y sangre menstrual, u otras evidencias relacionadas con agresiones sexuales. Este procedimiento utiliza una técnica de extracción diferencial aplicada a almohadillas de muestra de pruebas inmunocromatográficas, donde las almohadillas de muestra sirven como sustrato. El método implica dos pasos de lisis secuenciales para separar efectivamente las fracciones no espermáticas y espermáticas, permitiendo el aislamiento dirigido de tipos celulares distintos para análisis de ADN posterior. La eficiencia de este procedimiento se demuestra en los resultados dentro de este documento, que resalta la recuperación exitosa de perfiles autosómicos masculinos y Y-STR, incluso en muestras mixtas con una alta presencia femenina. En general, este protocolo demuestra la recuperación efectiva de ADN de almohadillas de muestra, lo cual es beneficioso para los profesionales forenses que trabajan con cantidades limitadas de muestra, subrayando el valor de utilizar estas almohadillas en análisis forenses.