Este protocolo describe un método robusto para la extracción de metabolitos intra y extracelulares de mono y co-cultivos bacterianos intestinales. En los últimos años, las técnicas de co-cultivo empleadas en el campo de la microbiología han demostrado una importancia significativa en lo que respecta a la comprensión de las interacciones célula-célula, la alimentación cruzada y las interacciones metabólicas entre diferentes bacterias, hongos y consorcios microbianos que permiten la imitación de condiciones de cohabitación complejas. Este protocolo destaca un cultivo robusto, reproducible y fisiológicamente relevante y un protocolo de extracción para el co-cultivo de bacterias intestinales. Los nuevos pasos de extracción se realizan sin utilizar la detención y la ruptura celular a través de métodos de células con cuentas, ciclos de congelación y descongelación, y sonicación, que tienden a afectar las propiedades físicas y bioquímicas de los metabolitos intracelulares y el secretoma. El procedimiento de extracción de co-cultivos bacterianos inoculados y monocultivos utiliza filtración al vacío rápida y centrifugación. La metodología de extracción es rápida, efectiva y robusta, requiriendo 4 h para completarse.