El endotelio corneal es una capa única de células especializadas que recubre la superficie posterior de la córnea y mantiene la hidratación y la transparencia corneal, esenciales para la visión. Actualmente, el trasplante es la única opción terapéutica para las enfermedades que afectan al endotelio corneal. El trasplante de endotelio corneal, llamado queratoplastia endotelial, se utiliza ampliamente para las enfermedades endoteliales corneales. Sin embargo, el trasplante de córnea está limitado por la escasez global de donantes. Por lo tanto, es necesario superar la deficiencia de tejido corneal donante suficiente. Se están explorando nuevos enfoques para diseñar tejidos corneales de manera que se disponga de una cantidad suficiente de endotelio corneal para compensar la actual escasez de córneas funcionales. Aunque las células endoteliales corneales humanas tienen una capacidad proliferativa limitada, varios laboratorios han tenido éxito en la expansión de células endoteliales corneales humanas. Aquí proporcionamos un análisis exhaustivo de diferentes sustratos empleados para el cultivo de células endoteliales corneales humanas. También se presentan los avances y los desafíos emergentes con la capa endotelial corneal cultivada para el objetivo final de reemplazo terapéutico del endotelio corneal disfuncional en humanos por endotelio corneal funcional.