El esperma equino criopreservado es vital para el comercio global y la preservación genética. Sin embargo, los antimicrobianos incluidos en los extensores de semen para este procesamiento pueden estar exacerbando el desarrollo de resistencia a los antimicrobianos, que es reconocida por la Organización Mundial de la Salud como una importante amenaza para la salud global. Esta investigación evaluó tres métodos de procesamiento diferentes: centrifugación simple (con/sin antibióticos), filtración y centrifugación coloidal, ambos sin antibióticos, evaluando su efecto en la carga microbiana, motilidad y viabilidad en esperma equino congelado-descongelado. El análisis de la carga microbiana post-congelación mostró una reducción similar en todos los métodos, con la filtración y la centrifugación coloidal sin antibióticos logrando valores comparables al grupo de control con antibióticos. Los resultados no revelaron diferencias significativas en la motilidad progresiva, la velocidad media de trayectoria, la velocidad en línea recta o los parámetros de oscilación entre los protocolos. Sin embargo, la motilidad total fue menor en los métodos de filtración y centrifugación coloidal sin antibióticos en comparación con la centrifugación simple con antibióticos. La viabilidad fue significativamente mayor en el grupo de control con antibióticos que en los otros tratamientos sin antibióticos. Estos hallazgos sugieren que las técnicas de procesamiento alternativas propuestas, cuando se combinan con prácticas de higiene optimizadas, podrían controlar la carga microbiana y mantener la calidad del semen en esperma criopreservado sin antibióticos, ofreciendo una estrategia prometedora para reducir la resistencia a los antimicrobianos. Se recomienda realizar más investigaciones para validar estos resultados y apoyar su aplicación más amplia.