Brycon hilarii es un pez migratorio ampliamente distribuido en la cuenca del río Paraguay. Es apreciado en la pesca deportiva y por la excelente calidad de su carne. Además, es la principal especie de atracción turística en la región de Bonito (Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil). Dada la falta de información sobre la estructura genética de los peces de esta especie, el objetivo del presente estudio fue detectar la variabilidad genética de Brycon hilarii mediante marcadores RAPD. Se utilizaron para el análisis ochenta especímenes recolectados en diferentes temporadas en cuatro sitios de la subcuenca del río Miranda (Cuenca del río Paraguay, Brasil). Los resultados de similitud genética, diversidad de Shannon y AMOVA revelaron diferencias entre los sitios de muestreo. Mediante AMOVA, las diferencias entre poblaciones fueron más evidentes entre los animales recolectados durante la temporada no reproductiva, que corresponde a un período de menor movimiento de estos peces. Se sugirió un modelo de estructuración poblacional en el que B. hilarii aparece organizada en unidades reproductivas genéticamente diferenciadas que coexisten y comigran a través del sistema estudiado, lo que contrasta con la idea actualmente aceptada de que los peces migratorios de agua dulce forman grandes poblaciones panmícticas en un sistema hidrográfico determinado. A pesar de la falta de un panorama completo sobre la distribución de B. hilarii en la región estudiada, esta idea inicial sobre su estructura genética poblacional podría ser una contribución importante para los programas de gestión y conservación de estos peces.