La susana de ojos negros (L.), una planta con flores con diversos usos medicinales tradicionales, ha despertado recientemente interés por sus propiedades terapéuticas. Sin embargo, se sabe poco sobre las posibles actividades terapéuticas de esta especie vegetal. El estudio actual se centró en realizar una investigación exhaustiva sobre la composición química y la bioactividad de la susana de ojos negros cultivada en Rumanía. El perfil metabolómico no dirigido y el análisis fitoquímico UHPLC-HR-MS del extracto estudiado revelaron la presencia de más de 250 compuestos pertenecientes a diferentes clases, incluyendo lactonas sesquiterpénicas, ácidos polifenólicos, flavonoides, aminoácidos y ácidos grasos. El extracto probado mostró actividad inhibitoria contra bacterias Gram-positivas y mostró una prometedora actividad antifúngica. También demostró potentes propiedades antioxidantes a través de la quelación de hierro y capacidades de inhibición de 15-LOX, así como inhibición del crecimiento celular, particularmente en la línea celular MCF-7, sugiriendo posibles efectos anticancerígenos. Por lo tanto, la investigación actual proporciona información valiosa sobre el potencial antioxidante, antimicrobiano y antitumoral de las flores. Implícitamente, el descubrimiento de una tan amplia gama de biosustancias, junto con la actividad biológica observada para el extracto estudiado en estos estudios preliminares in vitro, allana el camino para futuras investigaciones sobre la posible aplicación de la planta en los sectores farmacéutico y nutracéutico.