El RNA-seq enfrenta desafíos persistentes debido a la continua y creciente variedad de flujos de trabajo de procesamiento de datos, ninguno de los cuales ha logrado estandarización hasta la fecha. Es imperativo determinar qué método preserva más efectivamente los hechos biológicos. Aquí, utilizamos la entropía de Shannon como una herramienta para representar el estado biológico de un sistema. Así, evaluamos la medición de la entropía de Shannon mediante varios enfoques de flujo de trabajo de RNA-seq, como DESeq2 y edgeR, pero también combinando nueve métodos de normalización con el cambio logarítmico en muestras emparejadas de RNA-seq de TCGA que representan conjuntos de datos de 515 pacientes y abarcan 12 tipos diferentes de cáncer con tasas de supervivencia general a 5 años que varían del 20% al 98%. Nuestro análisis reveló que la normalización TPM, RLE y TMM, junto con un umbral de cambio logarítmico >=1, para identificar genes expresados diferencialmente, arrojó los mejores resultados. Proponemos que la entropía de Shannon puede servir como una métrica objetiva para refinar la optimización de los flujos de trabajo de RNA-seq y las tecnologías de secuenciación de ARNm.