Las hojas de las plantas presentan una intrincada variedad de capas que proporcionan una barrera robusta contra patógenos y factores de estrés abióticos. Sin embargo, estas capas también pueden constituir un obstáculo para la evaluación de procesos intracelulares, especialmente al utilizar enfoques de microscopía de fluorescencia. Los métodos actuales para determinar el potencial de membrana mitocondrial en las hojas se han realizado tradicionalmente en secciones delgadas del mesófilo, en protoplastos aislados o en plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes. Esto puede limitar la cantidad de información obtenida sobre la morfología mitocondrial general en hojas intactas. Aquí, detallamos un protocolo rápido y sencillo para evaluar los cambios en el potencial de membrana mitocondrial en las hojas asociados con disfunción mitocondrial en la planta modelo. Este protocolo también permite la evaluación de la forma, dinámica y polaridad mitocondrial en hojas sometidas a diversas condiciones de estrés.