La evaluación de los niveles de rendimiento en caballos atléticos es de gran importancia para prevenir lesiones deportivas. La espectroscopia Raman es una técnica innovadora que permite una evaluación rápida de biomoléculas en fluidos biológicos. También permite análisis de muestras cualitativos y cuantitativos, lo que conduce a la determinación simultánea de los componentes de los fluidos biológicos examinados. Con base en esto, se aplicó la técnica de espectroscopia Raman en muestras de suero recolectadas de cinco caballos de silla italianos sometidos a un recorrido de obstáculos estandarizado precedido de un calentamiento para evaluar la aplicabilidad de esta técnica para la evaluación de la fatiga central y periférica en caballos atléticos. Las muestras de sangre se recolectaron mediante punción venosa yugular en un tubo vacutainer con un activador de coagulación antes del ejercicio, inmediatamente después del ejercicio, y 30 min y 1 h después del final del recorrido de obstáculos. Al observar los espectros Raman obtenidos, los principales cambios debidos a las condiciones experimentales aparecieron en las bandas (1300-1360) cm y (1385-1520) cm. En la banda (1300-1360) cm, se identificaron lípidos y triptófano; en la banda (1385-1520) cm, se identificaron leucina, glicina, isoleucina, ácido láctico, tripeptido, adenosina y beta caroteno. Se registró un efecto significativo del ejercicio en todas las sub-bandas. En particular, se encontró un cambio inmediatamente después del ejercicio en comparación con antes del ejercicio. Además, la concentración media de ácido láctico se correlacionó positivamente con el área Raman de la sub-banda asignada al ácido láctico. En este contexto, la aplicación de la espectroscopia Raman en muestras de suero sanguíneo representa una técnica útil para la identificación de la estructura secundaria de proteínas para investigar los cambios metabólicos que ocurren en caballos atléticos durante el ejercicio físico.