La mucopolisacaridosis IVA (MPS IVA) es una enfermedad de almacenamiento lisosomal causada por mutaciones en el gen que codifica la hidrolasa N-acetilgalactosa-6-sulfato sulfatasa (GALNS). La deficiencia de GALNS provoca una acumulación progresiva de condroitín-6-sulfato y queratán-6-sulfato parcialmente degradados en los lisosomas. Se están evaluando diversas estrategias terapéuticas. Recientemente, validamos el uso de la terapia génica basada en CRISPR/Cas9 para la MPS IVA, recuperando hasta el 40 % de la actividad normal de GALNS, lo que resulta en un resultado positivo en los biomarcadores clásicos de MPS IVA. En este estudio, ampliamos nuestros hallazgos previos mediante la administración conjunta del sistema CRISPR/Cas9 con las proteínas E4orf6 o E1B, inhibidoras de la vía de reparación por unión de extremos no homólogos, lo que podría favorecer un aumento del mecanismo de reparación dirigido por homología. Los vectores CRISPR/Cas9 se transfectaron en fibroblastos humanos MPS IVA GM00593 y GM01361 mediante lipofección. Tras 30 días de la transfección con los sistemas CRISPR/Cas9 en ausencia de E4orf6 o E1B, observamos un aumento de la actividad de GALNS de hasta 4,17 y 11,2 veces en comparación con las células GM01361 y GM00593 no tratadas, respectivamente. Se logró una recuperación parcial de la masa lisosomal en fibroblastos humanos de MPS IVA tras el tratamiento, mientras que solo se observó una modesta reducción del estrés oxidativo en las células GM01361 tratadas. Ninguna de estas células transfectadas con plásmidos CRISPR/Cas9 que expresan E4orf6 o E1B mostró una mejora en las variables de prueba. En conjunto, nuestros resultados respaldan el uso de CRISPR/Cas9 como una posible estrategia basada en GT para el tratamiento de MPS IVA y resaltan la importancia de buscar enfoques para mejorar el impacto de la edición génica como enfoque terapéutico.