Erythrolamprus poecilogyrus sublineatus (Cope, 1860) es una especie ampliamente distribuida en el Dominio Pampa, presente en Rio Grande do Sul, Argentina y Uruguay. En la región costera del sur de Brasil, es una de las especies de serpientes más abundantes. El propósito del presente estudio es describir las técnicas de evaluación espermática in vitro para E. poecilogyrus sublineatus. Tras la laparotomía, se recolectaron los vasos eferentes y el semen se diluyó en 1 ml de solución de descongelación Beltsville. Se evaluaron las características de motilidad, integridad de la membrana, mitocondrias, acrosoma, ADN, viabilidad celular y funcionalidad celular. Se utilizaron sondas fluorescentes para la evaluación de la estructura espermática en el microscopio de epifluorescencia. Con las técnicas descritas, fue posible identificar células intactas y lesionadas, lo que permitió determinar las características celulares para la temporada de primavera (octubre y noviembre). Se observó en los análisis que el 80 % de los espermatozoides eran móviles y que el 84,1 ± 8,0 % de las membranas espermáticas estaban intactas. Los estándares encontrados fueron un 48 ± 13,8 % de acrosoma intacto, un 73,6 ± 6,0 % de ADN íntegro y un 91,8 ± 4,0 % de mitocondrias funcionales. Por lo tanto, estos valores del análisis de espermatozoides pueden utilizarse como estándares para Erythrolamprus poecilogyrus sublineatus.