Se realizó una encuesta sobre el uso de plantas medicinales en las comunidades rurales de la subregión de Río Negro del Pantanal y los raizeiros de los municipios de Aquidauana y Miranda, Mato Grosso do Sul, Brasil, con el fin de recuperar el conocimiento etnobotánico y etnofarmacológico de estas comunidades. Se aplicaron cuestionarios estructurados a los residentes de ocho fincas y 12 raizeiros. Los resultados revelan 25 familias botánicas, 45 géneros y 48 especies de plantas medicinales utilizadas, seis de las cuales están indicadas para trastornos renales, seis para trastornos urinarios, cinco para el tratamiento de inflamaciones, 13 para dolores de estómago, 10 para trastornos respiratorios, cuatro para tratar esguinces, cuatro para cicatrizar heridas, cuatro como antidiarreico y uno como antipirético, entre otras enfermedades. La familia principal fue Asteraceae, con 12 especies utilizadas. Los principales métodos de preparación de las hierbas medicinales en la subregión de Río Negro y sus alrededores eran la infusión (35) y, principalmente, la mezcla con chimarrão o mate quente, bebida tradicional. Los raizeiros utilizan diecinueve especies exóticas (39,58%), lo que indica una fuerte influencia del entorno urbano. Los pantaneiros tradicionales tienen mayor conocimiento de las plantas medicinales que los raizeiros, y solo mencionaron cinco especies exóticas (16,1%).