Este estudio tiene como objetivo determinar el balance de masa de robenidina hidrocloruro (ROBH) en el cuerpo del pez gato de canal. Se administró ROBH por vía oral a una dosis de 20 mg/kg; tras la administración del fármaco, se recolectaron muestras de agua en momentos predeterminados (12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h), los peces experimentales fueron sacrificados después de que se obtuvieron las muestras de agua a las 168 h, y las muestras de tejido se recolectaron por separado de los huesos. Las muestras de agua y tejido se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) para determinar las concentraciones de ROBH y sus posibles metabolitos principales, ácido 4-clorohipúrico (PCHA) y ácido 4-clorobenzoico (PCBA). Las muestras de tejido se prepararon utilizando un procedimiento modificado de QuEChERS; las muestras de agua se prepararon utilizando un procedimiento de extracción líquido-líquido (LLE). Los resultados muestran que la tasa de recuperación de ROBH en los peces es muy baja, menos del 2% de la cantidad total del fármaco, y la recuperación en agua puede alcanzar el 80.7% de la cantidad total del fármaco. El contenido de PCBA representó el 42.4% de la cantidad total del fármaco; el contenido de ROBH representó el 38.3% de la cantidad total del fármaco. El contenido de PCHA representó menos del 1% de la cantidad total del fármaco. Los resultados muestran que, después de una administración única, ROBH se metaboliza rápidamente in vivo y se excreta en forma de ROBH así como del metabolito PCBA. ROBH y PCBA pueden ser utilizados como los principales objetivos para la detección del metabolismo de ROBH en el pez gato de canal.